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一组检测先天性纤维蛋白原缺陷的生物标记及其检测试剂盒

发明公布  在审
申请(专利)号:CN201811522402.2国省代码:天津 12
申请(专利权)人:天津协和华美医学诊断技术有限公司
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摘要:
本发明提供了一组检测先天性纤维蛋白原缺陷的生物标记及其检测试剂盒,涉及分子生物学技术领域。检测先天性纤维蛋白原缺陷的生物标记为突变基因群,包括FGA、FGB、FGG共3个基因的突变基因的集合,其外显子区域共携带201个突变位点。检测先天性纤维蛋白原缺陷的试剂盒包括用于扩增先天性纤维蛋白原缺陷的突变基因群中突变基因的引物。该试剂盒具有检测效率高、突变基因覆盖面广、检出率高等优点,使用该检测试剂盒所给出的医学解读报告更加准确、权威。

主权项:
1.一组检测先天性纤维蛋白原缺陷的生物标记,其特征在于,所述的生物标记为突变基因群,所述的突变基因群包括FGA、FGB、FGG共3个基因的突变基因的集合;所述的突变基因的外显子区域共携带201个突变位点;所述的201个突变位点为:


说明书

一组检测先天性纤维蛋白原缺陷的生物标记及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域,具体涉及一组检测先天性纤维蛋白原缺陷的生
物标记-突变基因群及其检测试剂盒。

背景技术

纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)是一种含有2964个氨基酸的大分子糖蛋白,由Aα,B
β,γ,3条多肽链以链间二硫键即AαCys28,γCys8和Cys9相连构成的对称性二聚体,3条多
肽链分别由3个独立的基因FGA、FGB、FGG编码。

先天性纤维蛋白原缺陷是一类以低纤维蛋白原血症或者异常纤维蛋白原血症为
特征的罕见疾病,临床表现主要为淤点、瘀斑或不同程度的出血症状,实验室检查可以发现
纤维蛋白原的抗原或者活性的异常,多数出现凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间
(aPTT)和凝血酶时间(TT)同时延长,但是也有部分患者没有明显出血的表现甚至是表现为
血栓的症状。迄今为止,在国内,先天性纤维蛋白原缺陷仍缺乏认识,诊断率低,实验室检查
项目不完善,常被与其他凝血因子缺乏或者是出血性疾病混淆,使先天性纤维蛋白原缺陷
一直处于被低估的状态。常规的诊断方法有凝血酶时间测定、纤维蛋白原水平检测和纤维
蛋白原活性检测,以及血栓止血相关实验室检查等。但是在实验室的常规检测中,纤维蛋白
原的检测项目并不十分完善,而且上述检测方法操作繁琐复杂,并且仍然存在很大误诊或
漏诊的可能。

近年来,对于先天性纤维蛋白原缺陷分子发病基础研究取得了显著进展,目前已
知的主要关于先天性纤维蛋白原缺陷的致病基因有FGA、FGB、FGG三个基因,1981年,
Higgins等首先报道了FGA的基因缺陷,发生Arg16His突变,产生异常纤维蛋白原血症。目
前,FGA基因突变类型已报道83种,FGB的基因缺陷75种,FGG基因的突变类型有43种。赵秘胜
等(2017)公开了7个纤维蛋白原γ链Arg275位点突变导致的遗传性异常纤维蛋白原血症家
系的基因型与临床特征分析,在15例Arg275突变患者中共发现了Arg275His和Arg275Cys两
种突变类型。现有已公布的FGA突变包括Gly13Arg,Arg16His,Argl6Cys,Arg35His,
Cys36Arg等,FGB突变包括Asn190Ser等,FGG突变包括Asp185Asn,Arg275His,Arg275Cys,
Arg301His等。

通过基因检测能够快速有效的对疾病进行诊断并作出分型,其中分子生物学的实
验方法主要有巢式PCR、一代测序等。PCR方法不能直观的得到具的突变序列,一代测序的方
法受到测序通量的影响,无法一次性检测多个基因的全部外显子区域,而二代测序作为一
种高通量的检测方法,可以一次性准确检测多个基因的外显子以及相关序列,使精准诊断
先天性纤维蛋白原缺陷成为可能。由于Fg基因突变位点众多,而现已知的突变位点较少,为
了使先天性纤维蛋白原缺陷基因诊断的更加全面,覆盖面更广,提供更多的突变位点及其
检测试剂盒成为必然的趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一组检测先天性纤维蛋白原缺陷的生物标记及其检测试
剂盒,克服了现有技术中存在的问题,提高了对先天性纤维蛋白原缺陷的诊断的准确性。

本发明一方面提供了一组检测先天性纤维蛋白原缺陷的生物标记,所述的生物标
记为突变基因群,所述的突变基因群包括FGA、FGB、FGG共3个基因的突变基因的集合;

所述的突变基因的外显子区域共携带201个突变位点;

所述的201个突变位点如表1所示:




本发明另一方面提供了一种先天性纤维蛋白原缺陷的生物标记在制备检测先天
性纤维蛋白原缺陷的试剂盒中的应用。

所述的试剂盒包含用于检测上述的201个突变位点的试剂。

本发明另一方面还提供了一种检测先天性纤维蛋白原缺陷的试剂盒,所述的试剂
盒包括:用于检测上述的201个突变位点的试剂。

所述的检测试剂包括用于扩增上述的201个突变位点的的PCR引物如表2所示:






所述的检测试剂盒还包括将基因组DNA制成可供测序的文库的试剂,该种试剂为
本领域常规使用试剂,只要能够满足PCR扩增对基因组DNA质量的要求即可。所述试剂制备
方法为本领域常规制备方法,较佳地为市售可得,如:二代测序DNA快速建库试剂盒(Ion
Torrent),二代测序快速DNA建库试剂盒(Illumina),NGS建库试剂盒(Illumina)等。

所述的试剂盒还包括用于二代测序的试剂,利用本发明提供的扩增引物,扩增得
到的单个片段长度为275bp左右,结合二代测序技术,能够检测本发明所述突变基因群中的
全部外显子区域。

其中所述用于二代测序的试剂为本领域常规使用的试剂,只要能够满足对所得序
列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法,较佳地为市售可
得,如:二代测序文库定量试剂盒,测序试剂试剂盒等。

所述的试剂盒还包括dNTP溶液,DNA聚合酶,用于分离或纯化核酸的试剂,阳性对
照和/或阴性对照。

用于分离或纯化核酸的试剂可以是Beckman磁珠。

优选地,所述的阳性对照为本领域常规的阳性对照,较佳地为包含本发明所述突
变基因群中突变基因序列的基因组DNA储备液或包含相应突变基因群中突变基因序列的质
粒作为阳性对照。

优选地,所述的阴性对照为本领域常规的阴性对照,较佳地为源于健康人经确认
不包含突变基因序列的野生型基因组DNA序列储存液。

所用的样本为检测对象的组织,只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA
即可。

优选地,所用的检测样本为血液、骨髓、实体组织样本中的一种或几种,更优选地,
检测样本为血液。

一种本发明所述试剂盒的使用方法,其包括以下步骤:

(1)利用本发明所述检测试剂盒抽提检测对象的外周血,提取基因组DNA;

(2)用PCR引物对基因组DNA中发明中所述3个先天性纤维蛋白原缺陷相关基因的
外显子区域进行扩增;

(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供Ion Torrent测序平台测序的文库;

(4)对步骤(3)中所得DNA文库进行测序,得到下机数据;

(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析,而后利用医学解读数据库进行解读
做出诊断即可。

本发明所用的试剂和原料均市售可得。

所用的医学解读数据库如下:

(1)已知FGA基因突变与先天性纤维蛋白原缺陷相关,先天性纤维蛋白原缺陷通常
为常染色体不完全隐性遗传病,多有近亲婚配史,患者终身有不同程度的出血症状。实验室
检查血浆纤维蛋白原水平降低,常低于正常值的50%,无纤维蛋白原血症时血FIB(纤维蛋
白原)检测微量,常<20mg/dL,血小板数量及功能正常,APTT(活化部分凝血活酶时间)、PT
(血浆凝血酶原时间)、TT(血浆血酶时间)均延长,可被输入正常的血浆及纤维蛋白原纠正,
患者亦可出现纤维蛋白原的结构异常导致其功能改变,女性多见,约半数患者无症状,可出
现轻度出血倾向以及血栓形成;

(2)已知FGB基因突变与先天性纤维蛋白原缺陷相关,先天性纤维蛋白原缺陷通常
为常染色体不完全隐性遗传病,多有近亲婚配史,患者终身有不同程度的出血症状。实验室
检查血浆纤维蛋白原水平降低,常低于正常值的50%,无纤维蛋白原血症时血FIB检测微
量,常<20mg/dL,血小板数量及功能正常,APTT、PT、TT均延长,可被输入正常的血浆及纤维
蛋白原纠正,患者亦可出现纤维蛋白原的结构异常导致其功能改变,女性多见,约半数患者
无症状,可出现轻度出血倾向以及血栓形成;

(3)已知FGG基因突变与先天性纤维蛋白原缺陷相关,先天性纤维蛋白原缺陷通常
为常染色体不完全隐性遗传病,多有近亲婚配史,患者终身有不同程度的出血症状。实验室
检查血浆纤维蛋白原水平降低,常低于正常值的50%,无纤维蛋白原血症时血FIB检测微
量,常<20mg/dL,血小板数量及功能正常,APTT、PT、TT均延长,可被输入正常的血浆及纤维
蛋白原纠正,患者亦可出现纤维蛋白原的结构异常导致其功能改变,女性多见,约半数患者
无症状,可出现轻度出血倾向以及血栓形成。

与现有技术相比,本发明的积极和有益效果在于:

本发明提供的一组检测先天性纤维蛋白原缺陷的突变基因群及其检测试剂盒,可
用于筛查先天性纤维蛋白原缺陷的突变基因群,结合高通量测序技术,可以实现在分子生
物学层面对先天性纤维蛋白原缺陷进行诊断,特别是对于疾病后续的治疗方向和效果做出
预判具有特殊的优势。本发明提供的检测试剂盒具有检测效率高、突变基因覆盖面广、检出
率高等优点,使用该检测试剂盒所给出的医学解读报告更加准确、权威。

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对
于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行
若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施
例的下述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改
对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本
发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示
的这些实施例中,而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范
围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材
料,本文在此处列举优选的方法和材料。

除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的
普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件
(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或
者按照产品说明书进行。

实施例1中国人群先天性纤维蛋白原缺陷突变基因群的筛选

材料和方法:

在中国医学科学院血液病医院和协和华美医学诊断中心2017年1月至2018年7月
诊断的患者中,根据以下标准,进行连续性入组(23名)。

入选标准为:经临床症状和相关实验室检查诊断为纤维蛋白原缺陷的患者,并且
筛选需要进行基因检测以进行辅助确认是否为先天性纤维蛋白原缺陷的病例,23名患者的
诊断结果如表3所示。

表3患者诊断结果列表:



收集3mL患者外周血提取基因组DNA待测,该检测经过中国医学科学院血液病医院
伦理委员会批准。

1.样本处理:样本中基因组利用DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司,货
号:DP318-03)进行抽提,具体操作方法:(1)预处理:①在1.5mL的EP管中加入500ul全血,样
品中加入800ul的细胞裂解液CL,颠倒混匀,10000rpm离心1min;②吸去上清,留下细胞核沉
淀;③向收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS,振荡至彻底混匀。(2)裂解细胞:①加入
20μl Proteinase K溶液,混匀;②加200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,其间颠倒混匀数次,56
℃放置10min,溶液应变清亮。(3)DNA沉淀及过柱吸附:①加200μl无水乙醇,立即充分颠倒
混匀;②将上一步所得溶液和絮状沉淀加入吸附柱CB3中,12000rpm离心30s,将吸附柱CB3
放入新收集管。(4)去蛋白、漂洗:①向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD,12000rpm离心30s,
将吸附柱CB3放入新收集管;②向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW,12000rpm离心30s,将吸
附柱CB3放入新收集管;③重复操作步骤7;④12000rpm离心2min,将吸附柱CB3转入1.5mLEP
管中,将吸附柱CB3开盖置于生物安全柜中吹数分钟,晾干吸附材料中残余的漂洗液。(5)
DNA洗脱:①向吸附膜中间位置悬空滴加40μl提前预热的洗脱缓冲液TB,室温放置2-5min,
12,000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中;②测量浓度。

2.文库的构建:选取待测基因FGA、FGB和FGG的外显子编码区以及侧翼的部分内含
子区域,利用Ion扩增子测序文库构建试剂盒2.0-LV96(购自Thermo Fisher公司,货号:
4475345)对基因组DNA进行多重PCR方法建库,具体步骤如下:(1)PCR扩增基因组DNA的目标
区域:①根据浓度向DNA样本中加入纯水稀释至5ng/ul,包括pool1和pool2,分别建立反应
体系:



②加盖1400rpm瞬时离心,MixMate 2000r 5s混匀,1400rpm瞬时离心,进行PCR,反
应条件如下:


(2)酶切:离心PCR管,将pool1反应液转移到pool2-PCR管中,加入1.9μl的FuPa
Reagent,密封后混匀,离心、轻柔涡旋再离心,酶切反应条件如下:

温度
时间
50℃
20min
55℃
20min
60℃
20min
10℃
1h

(3)扩增有效文库:①溶解Switch Sloution,向每个酶切产物中加入相应体积的
Switch Solution和稀释好的Barcode,组分如下:

组分
体积
Switch Solution
4μl
Barcode
2μl
总体积
28ul

②每孔加入2μl的DNA ligase,混匀后反应条件如下:

温度
时间
22℃
30min
72℃
10min
10℃
1h

(4)纯化未扩增的文库:①DNA文库中每孔加入45μl AMPure Beads,涡旋5min
(1800rpm),室温放置5min,离心后将实验板移至磁力架上,放至澄清然后弃去上清,加入
150μl新鲜70%的酒精,旋转Ep管两圈或左右移动96孔板,弃去酒精;②重复一遍后风干磁
珠;取下EP管,加入100μl的Low TE分散磁珠,轻柔涡旋混匀;③室温放置2min后移至磁力架
上,待澄清后转移文库至干净EP管中。

3.模板制备:参考Ion Torrent测序仪配套设备One Touch的使用说明书,具体步
骤如下:(1)稀释文库和定量:①将建好的文库梯度至稀释200倍,充分涡旋后离心;②标准
品10倍梯度稀释到6.8pM,0.68pM,0.068pM,ABI 7500仪器反应体系如下:


Ion AmpliSeqTM DNA文库
2×Master Mix
5μl
20×TaqMan
0.5μl
样本(标准品)
4.5μl

反应条件如下:


(2)油包水PCR扩增:①将稀释到200倍的文库充分涡旋混匀,反应体系如下:



*:文库上样量按照qRT-pcr定量结果进行计算,在700~750pmol总上样量进行调
整。

②选择Proton:Ion PITMHi-QTMOT2 200Kit程序运行油包水PCR反应;③取下油包
水PCR反应后的Recovery Tube,弃去上层的Recovery溶液,重悬微珠,配制Melt-off溶液,
体系如下:

顺序
组分
体积
1
Tween溶液
280μl
2
1M NaOH
40μl

总体积
320μl

(3)磁珠富集:涡旋MyOneTMStreptavidin C1Beads加入130μL-Ion
PITMMyOneTMBeads Capture Solution进行富集。(4)One touch and ES:①将对应试剂转移
ES专用8连管进行ES反应,顺序如下:

8连排孔号
试剂
1
100μl的阳性ISP模板
2
130μl-MyOneTMBeads洗脱液
3
300μl Ion PITMES Wash Solution
4
300μl Ion PITMES Wash Solution
5
300μl Ion PITMES Wash Solution
6

7
300μl-Melt-off溶液
8

②离心ES后的ISP 5min 15500g,弃上清仅留10ul重悬微珠;清洗并离心ES后的
ISP 5min 15500g,弃上清留取10ul重悬磁珠,补水至100ul,吹吸混匀10次。

4.测序反应:参考高通量测序仪Ion Torrent使用说明书,具体步骤如下:(1)制备
测序样品:①涡旋Ion PITMControl Ion SphereTM particles 5s,离心2s,加4μl到ES后的
重悬液中,轻柔涡旋,15500rpm离心3min;②弃去上清,留10μl,然后加入15μl-Ion PITM
Annealing Buffer,再加入20ul Sequencing Primer,轻柔涡旋,离心2s;测序引物退火反
应:95℃,2min;37℃,2min;25℃维持;(2)离心PCR管,加入10ul Loading Buffer,混匀并离
心,共55ul;(3)Ion-Proton测序仪水洗、氯洗及初始化;(4)Loading芯片;(5)上机测序。

5.生物信息学分析:使用Ion Report软件(v4.6,Thermo Fisher,Carlsbad,CA,
USA)过滤低质量的测序片段,并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://
hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html),使用Torrent Variant Caller(v4.6.0.7)
子程序检测突变位点,软件参数使用的是默认的设置。此软件已经被优化用于处理Ion
Torrent测序平台特有的错误类型。对找出的突变包括SNP和Indel使用ANNOVAR(http://
annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)软件进行注释,注释内容包括突变在基因
组中的位置,关联的基因,基因外显子编号,核苷酸水平变异,对应的蛋白水平变异,以及该
突变在dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/),千人基因组数据库
1000Genomes(http://www.1000genomes.org/),外显子组整合数据库ExAC(http://
exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/
ac/index.php)中的注释,PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT
(http://sift.jcvi.org/)功能预测结果等。

进一步使用以下原则筛选致病突变位点:(1)根据突变所在的基因组位置和类型,
过滤掉对蛋白产物序列不产生影响的突变;(2)利用1000Genomes数据和ExAC数据,注释每
个突变在人群中的比例,如果比例小于等于1%则不认为是多态性位点;(3)检索人类基因
突变数据库,查询一个突变在HGMD中是否有记载,其出现在先天性纤维蛋白原缺陷等相关
疾病中;(4)利用蛋白质功能预测软件PolyPhen-2和SIFT预测该突变是否影响蛋白功能;
(5)如果经过(2)(3)(4)后,一个突变满足“非多态性”、“先天性纤维蛋白原缺陷记载过”和
“影响蛋白功能”这三条中至少两条,将被判为与疾病可能相关。如果一个突变虽然不满足
(5)但是在HGMD中有记录,则被判读为意义不明的突变,最后如果一个突变在文献中被明确
记载为与疾病高度相关,则直接判为热点突变。

6.统计分析:统计每个基因携带致病突变的比例,筛选出突变率最高的基因,使用
的软件为Excel。

7.医学解读:用医学解读数据库对生物信息学分析得出的基因突变型做出分子病
理诊断。所用的医学解读数据库如下:

(1)已知FGA基因突变与先天性纤维蛋白原缺陷相关,先天性纤维蛋白原缺陷通常
为常染色体不完全隐性遗传病,多有近亲婚配史。患者终身有不同程度的出血症状。实验室
检查血浆纤维蛋白原水平降低,常低于正常值的50%,无纤维蛋白原血症时血FIB检测微
量,常<20mg/dL,血小板数量及功能正常,APTT、PT、TT均延长,可被输入正常的血浆及纤维
蛋白原纠正。患者亦可出现纤维蛋白原的结构异常导致其功能改变,女性多见,约半数患者
无症状,可出现轻度出血倾向以及血栓形成。

(2)已知FGB基因突变与先天性纤维蛋白原缺陷相关,先天性纤维蛋白原缺陷通常
为常染色体不完全隐性遗传病,多有近亲婚配史。患者终身有不同程度的出血症状。实验室
检查血浆纤维蛋白原水平降低,常低于正常值的50%,无纤维蛋白原血症时血FIB检测微
量,常<20mg/dL,血小板数量及功能正常,APTT、PT、TT均延长,可被输入正常的血浆及纤维
蛋白原纠正。患者亦可出现纤维蛋白原的结构异常导致其功能改变,女性多见,约半数患者
无症状,可出现轻度出血倾向以及血栓形成。

(3)已知FGG基因突变与先天性纤维蛋白原缺陷相关,先天性纤维蛋白原缺陷通常
为常染色体不完全隐性遗传病,多有近亲婚配史。患者终身有不同程度的出血症状。实验室
检查血浆纤维蛋白原水平降低,常低于正常值的50%,无纤维蛋白原血症时血FIB检测微
量,常<20mg/dL,血小板数量及功能正常,APTT、PT、TT均延长,可被输入正常的血浆及纤维
蛋白原纠正。患者亦可出现纤维蛋白原的结构异常导致其功能改变,女性多见,约半数患者
无症状,可出现轻度出血倾向以及血栓形成。

对中国人群先天性纤维蛋白原缺陷突变基因群的筛选结果如表1所示,先天性纤
维蛋白原缺陷突变基因群包括FGA、FGB和FGG共3个基因的突变基因的集合,其外显子区域
共携带201个突变位点,可用于检测先天性纤维蛋白原缺陷的相关疾病。

实施例2合成检测试剂盒所需的引物

引物设计:针对本发明所述突变位点,利用Ion AmpliSeq Designer软件设计扩增
所需的多重PCR引物,最终发现引物序列如表2所示的引物组合能够平衡、高效地扩增出所
有突变位点。

引物合成:将设计好的引物送至合成公司进行合成。

实施例3利用实施例2所述试剂盒检测临床先天性纤维蛋白原缺陷病人样本

(1)收集3mL实施例1所述的患者的外周血,利用DNA提取试剂盒(购自天根生化科
技有限公司,货号:DP318-03)提取基因组DNA,将包含本发明所述突变基因群中突变基因序
列的基因组DNA储备液作为阳性对照,将源于健康人经确认不包含突变基因序列的基因组
DNA序列储存液作为阴性对照;

(2)用实施例2所述试剂盒中的多重PCR引物对基因组DNA进行扩增,PCR扩增的反
应体系和反应程序为本领域常规方法;

(3)用实施例1中的方法将步骤(2)中扩增所得的片段利用二代测序Ion扩增子测
序文库构建试剂盒2.0-LV96(购自Thermo Fisher公司,货号:4475345)制成可供Ion
Torrent测序平台测序的文库;

(4)用实施例1中的方法对步骤(3)中所得DNA文库经油包水处理后在Ion Torrent
平台上进行高通量测序,得到下机数据;

(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析,而后利用医学解读数据库进行解读
做出诊断。23名患者所检测出3个基因的阳性率如下表4所示。

表4先天性纤维蛋白原缺陷相关基因阳性率:


经统计后结果表明:23例患者中检测到均为先天性纤维蛋白原缺陷,其中有携带
FGA基因突变患者13例,携带FGB基因突变患者7例,携带FGG基因突变患者3例,而且得出的<>...

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图1
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