PatViewer专利搜索

检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记及方法

发明公布  在审
申请(专利)号:CN201910121479.7国省代码:上海 31
申请(专利权)人:上海市农业科学院
温馨提示:Ctrl+D 请注意收藏,详细著录项请首页检索查看。 Please note the collection. For details, please search the home page.

摘要:
本发明公开了一种检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记及其方法,所述分子标记是根据Wxmq基因第4外显子497bp处发生由G→A的突变而设计的,命名为Wxmq–KASP。所述KASP标记引物包括两条正向特异性引物和一条反向通用引物。根据本发明提供的KASP标记进行基因分型,在PCR扩增后不用酶切和电泳,可以高通量检测多个样品,快速检测Wxmq等位基因在水稻分离群体中的分布情况,结果准确性好,与常规分子标记相比具有快捷、简便和成本较低等优点。本发明对水稻低直链含量基因Wxmq的分子标记辅助选择育种具有重要意义。

主权项:
1.检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记,其特征在于,所述KASP分子标记(Wxmq–KASP)的引物序列为:正向引物1:5'‑GATGAACACACGGTCGACTCCAT‑3';正向引物2:5'‑ATGAACACACGGTCGACTCCAC‑3';反向通用引物:5'‑GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA‑3'。


说明书

检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记及方法

技术领域

本发明涉及一种检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记及方法,属水
稻育种技术领域。

背景技术

水稻是中国主要的粮食作物,中国水稻常年种植面积保持在3000万公顷左右,稻
谷总产居于世界第一。中国也是世界最大的稻米消费国,有百分之六十以上的人口以稻米
为主食。长期以来,高产是稻育种的首要指标,随着人们生活水平的提高,对优质稻米的需
求与日俱增,稻米品质尤其是食味品质已经成为消费者和育种家的首要考虑因素。稻米
90%的组成成分是淀粉,而淀粉又由直链淀粉和支链淀粉组成,因此直链淀粉含量是影响
稻米食味品质最重要的因素。软米,又称半糯米,直链淀粉含量为10%左右,用软米蒸煮的
米饭具有软而不烂、富有弹性、回生程度小、冷后不易变硬等优点,近年来越来越受消费者
欢迎。

水稻Wx基因编码颗粒淀粉合成酶(granule-bound starch synthase,GBSS),是控
制大米直链淀粉含量的主效基因。在非糯稻品种中,Wx基因分化为Wxa和Wxb两种等位基因,
Wxa主要存在于野生稻和籼稻中,对应直链淀粉含量约20%~28%;粳稻中为Wxb,直链淀粉
含量对应为15%~19%;而糯稻中Wx基因的功能缺失,导致糯稻中几乎不含直链淀粉。控制
水稻低直链淀粉含量的基因目前已发现了14个,主要分布在第6、9、10和12染色体上。日本
科学家于1996年利用N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)对水稻品种越光进行诱变处理后育成了一
个软米品种‘Milky Queen’,用RT-PCR方法克隆‘Milky Queen’中的低直链淀粉含量基因后
发现(Sato H,Suzuki Y,Sakai M,and Imbe T.2002.Molecular characterization of
Wx-mq,a novel mutant gene for low-amylose content in endosperm of rice(Oryza
sativa L.).Breeding Science,52(2):131-135),与Wxb基因序列相比,‘Milky Queen’中
的Wx基因编码区有SNP1和SNP2两个突变位点,SNP1是第497位核苷酸由G突变为A,SNP2是第
595位核苷酸由T突变为C,从而导致第4外显子编码的第158位氨基酸由精氨酸置换为组氨
酸,以及第5外显子编码的第191位氨基酸由酪氨酸置换为组氨酸,进而影响到编码的颗粒
淀粉合成酶的活性,最终造成直链淀粉含量下降。‘Milky Queen’中突变的Wx基因被命名为
Wxmq。Wxmq基因的成功克隆为软米品种的分子标记辅助选择育种打下了基础。

利用基于表型选择的传统育种方法进行稻米直链淀粉含量的改良,选择准确性
差,需要对每一代群体的植株均进行直链淀粉含量的测定,操作繁琐,不利于实验材料的高
通量筛选。利用分子标记尤其是功能性分子标记进行直链淀粉含量的辅助选择,不受季节、
环境限制,选择准确性更高;不存在基因是否表达的问题,在苗期即可对植株的直链淀粉含
量进行基因型检测,大幅度提高了育种效率。单核苷酸多态性(SNP)是目前应用最为广泛的
分子标记,关于SNP位点的检测方法有直接测序、分子信标、蝎状探针、等位基因特异性PCR
(Allele specific PCR,AS-PCR)、CAPS(Cleaved amplified polymorphism sequences)、
竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive allele specific PCR,KASP)等。Wang等
(Wang C L,Zhang Y D,Zhu Z,Chen T,Zhao L,Lin J,Zhou L H.2009.Development of a
new japonica rice variety Nan-jing 46with good eating quality by marker
assisted selection.Molecular Plant Breeding,7(6):1070-1076)利用Wxmq基因开发了
一个CAPS标记,并成功应用于分子标记辅助选择育种,但是,利用CAPS标记需要对PCR扩增
产物进行酶切和电泳,在水稻育种过程中育种家需要筛选大量的后代材料,因此成本较高
且比较耗时。KASP是英国LGC(政府化学家实验室)公司提出的一种用于对基因组中SNPs和
特定位点上InDels进行精准双等位基因判断的技术。由于具有简便、快速、准确等优点,
KASP技术已经成为SNP分型的主流方法(Rasheed A,Wen W E,Gao F M,Zhai S N,Jin H,
Liu J D,Guo Q,Zhang Y J,Dresigacker S,Xia X C,He Z H.2016.Development and
validation of KASP assays for genes underpinning key economic traits in bread
wheat.Theor.Appl.Genet,129(10):1843-1860)。水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子
标记开发可以为软米新品种的高效分子标记辅助选择育种打下基础。

发明内容

本发明的目的是开发一个检测水稻低直链淀粉基因Wxmq的KASP分子标记并应用于
分子标记辅助选择育种,降低对大量样本进行Wxmq基因分子标记辅助选择的成本,提高育种
效率。

为实现本发明目的,本发明提供了一种检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP
分子标记(Wxmq–KASP),其特征在于,所述Wxmq–KASP分子标记的引物序列为:

正向引物1:5'-GATGAACACACGGTCGACTCCAT-3';

正向引物2:5'-ATGAACACACGGTCGACTCCAC-3';

反向通用引物:5'-GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA-3'。

进一步地,在合成Wxmq–KASP分子标记对应的引物时,正向引物1的5'端需加上FAM
荧光信号标签,FAM标签序列为5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3';正向引物2的5'端需加上
HEX荧光信号标签,HEX标签序列为5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。

另一方面,基于所述的KASP分子标记,本发明提供了检测水稻低直链淀粉含量基
因Wxmq的方法,包括以下步骤:

1)提取水稻待测样本的DNA;

2)采用Wxmq–KASP分子标记对待测样本的基因组DNA进行目标序列的PCR扩增;所述
KASP分子标记的引物序列为:

正向引物1:5'-GATGAACACACGGTCGACTCCAT-3';

正向引物2:5'-ATGAACACACGGTCGACTCCAC-3';

反向通用引物:5'-GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA-3';

3)对扩增后的样品进行基因分型检测,根据基因分型的结果判断样本材料中是否
具有低直链淀粉含量等位基因Wxmq

所述正向引物1的5'端加有FAM荧光信号标签,FAM标签序列为:5'-
GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3';所述正向引物2的5'端加有HEX荧光信号标签,HEX标签序列
为:5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。

优选地,步骤2中PCR扩增反应体系为10μL,包括2×KASP Master mix5μL,KASP
Primer mix 0.14μL,模板DNA 1.0μL,ddH2O 3.86μL。

优选地,步骤2中PCR扩增反应程序如下:94℃预变性15min;94℃变性20s;61-55℃
退火延伸60s,10个循环,每个循环降低0.6℃;94℃变性20s;55℃退火延伸60s,26个循环。

优选地,步骤3中基因分型的方法是PCR扩增反应结束后,采用PHERAstar PLUS酶
标仪检测PCR产物,然后将数据导入KlusterCaller数据处理软件进行分析。根据颜色分类,
聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型,聚合在
接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型,中间显示绿
色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型。左下角显示黑色的样本为空白对照。

与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明的检测水稻低直链淀粉含量
基因Wxmq的KASP分子标记(Wxmq–KASP),是根据Wxmq基因第4外显子497bp处发生由G→A的突
变开发得到,根据该发明提供的Wxmq–KASP标记进行基因分型,在PCR扩增后不用酶切和电
泳,可以高通量检测多个样品,大大提高了检测效率,为育种家筛选携带Wxmq等位基因的水
稻育种材料提供了一种高通量、低成本快速检测的方法,加快了育种进程。

附图说明

图1是利用Wxmq–KASP分子标记对‘南粳9108’、‘申01B’及其杂交F2代群体Wx等位基
因的分型示意图(样品板中添加了‘南粳9108’、‘申01B’以及两者的混合DNA样品各一份作
为阳性对照)。

图2是用CAPS标记对‘南粳9108’、‘申01B’及其杂交F2代群体部分植株Wx等位基因
的检测电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合附图和实施
例进一步阐述本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

实施例

1、水稻材料

所用实验材料为‘南粳9108’、‘申01B’以及两者杂交衍生的F2代群体。‘南粳9108’
是由江苏省农业科学院选育的携带低直链淀粉含量基因Wxmq的软米粳稻品种。‘申01B’是上
海市农业科学院作物育种栽培研究所选育的早熟晚粳保持系,中等直链淀粉含量。F2代群
体包含83个植株。2017年正季将供试材料种植于上海市农业科学院庄行综合试验站,常规
水肥管理。

2、水稻叶片DNA提取

水稻叶片在分蘖期采集,取100mg叶片加入液氮充分研磨,磨好的粉末利用天根生
化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。采用赛默飞世尔科技公
司的Nanodrop 2000分光光度计进行DNA浓度测定,调整DNA浓度到40ng/μL。

3、KASP分子标记设计

本发明提供的KASP标记(Wxmq–KASP)是根据Wxmq基因编码区第4外显子SNP1突变位
点开发得到,Wxmq–KASP标记引物根据互补链SNP1位点前后各50bp的碱基序列进行设计,包
括两条正向特异性引物和一条反向通用引物,两条正向引物分别对应FAM和HEX两种荧光信
号,具体引物序列信息如下:

(1)正向引物1:5'-GATGAACACACGGTCGACTCCAT-3';

正向引物2:5'-ATGAACACACGGTCGACTCCAC-3';

反向通用引物:5'-GAGAGGGTGAGGTTTTTCCATTGCTA-3'。

(2)FAM标签序列为5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3',HEX标签序列为

5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。

4、KASP分子标记Wxmq–KASP的实施

(1)PCR扩增反应

将提取的DNA分别加入全裙边96孔板,配制反应体系进行PCR扩增反应。

PCR反应体系:反应体系总体积为10μL,包括2×KASP Master mix 5μL,KASP
Primer mix 0.14μL,模板DNA 1μL,ddH2O 3.86μL。

PCR反应程序:94℃预变性15min;94℃变性20s;61-55℃退火延伸60s,10个循环
(每个循环降低0.6℃);94℃变性20s;55℃退火延伸60s,26个循环。

(2)KASP分子标记Wxmq–KASP的基因分型

反应结束后,采用PHERAstar PLUS酶标仪检测PCR产物,然后将数据导入
KlusterCaller软件进行聚类分析。根据检测的两种荧光的颜色分类,聚合在接近X轴的显
示蓝色的样本基因型为‘南粳9108’基因型,聚合在接近Y轴上的显示红色的样本基因型为
‘申01B’基因型,中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型。

基因分型结果显示(图1),83个单株被分成3组,其中21个单株与‘南粳9108’基因
型相同,42个单株为杂合基因型,20个单株与‘申01B’基因型相同(图1),符合1:2:1(χ2
0.055,p>0.05)的分离比。F2群体中共筛选出63个携带低直链淀粉含量等位基因Wxmq的单株
(表1)。

5、Wxmq–KASP标记检测结果的验证

为了进一步验证Wxmq–KASP标记检测结果的准确性,利用CAPS标记对“南粳9108”、
“申01B”及其杂交F2代群体的Wx等位基因进行检测。实验用CAPS标记引物、PCR扩增、NIaⅢ
酶切和电泳检测方法参照文献(Wang C L,Zhang Y D,Zhu Z,Chen T,Zhao L,Lin J,Zhou
L H.2009.Development of a new japonica rice variety Nan-jing 46with good
eating quality by marker assisted selection.Molecular Plant Breeding,7(6):
1070-1076)。结果显示在83个杂交F2代单株中,有21个单株表现为和‘南粳9108’一样的基
因型,有20个单株表现为与‘申01B’一样的基因型,其余42个单株表现杂合基因型,与Wxmq
KASP标记检测的结果完全一致(图2,表1)。该结果再次验证Wxmq–KASP标记能够准确的检测
出Wxmq等位基因。

表1Wxmq–KASP与CAPS标记基因分型结果的比对





以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和
原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 检测水稻低直链淀粉含量基因Wxmq的KASP分子标记及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgaacaca cggtcgactc cat 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacacac ggtcgactcc ac 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagagggtga ggtttttcca ttgcta 26

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 5

<211> 21

图1
©2018 IPPH.cn   PatViewer·专利搜索
主办单位:知识产权出版社有限责任公司  咨询热线:01082000860-8588
浏览器:IE9及以上、火狐等  京ICP备09007110号 京公网安备 11010802026659号