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鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的引物、方法及应用

发明公布  在审
申请(专利)号:CN201811532640.1国省代码:上海 31
申请(专利权)人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
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摘要:
本发明公开了一种鉴定间日疟原虫PvMSP‑3α基因多态性的引物及方法,包括上游引物(如SEQ ID NO:1所示)和下游引物(如SEQ ID NO:2所示)。根据基因多态性区域特征,设计特定的引物,经PCR扩增得到包含保守区域和多态性区域的DNA片段,通过测序、分析,能够对PvMSP‑3α基因是否突变进行鉴定,进而区分出是野生型还是突变型。此外,本发明还公开了该鉴定间日疟原虫PvMSP‑3α基因多态性的特异性引物在制备鉴定间日疟原虫PvMSP‑3α基因多态性的检测工具中的应用。

主权项:
1.一种鉴定间日疟原虫PvMSP‑3α基因多态性的引物,其特征在于,包括上游引物和下游引物,所述上游引物的序列是SEQ ID NO:1所示的序列,所述下游引物的序列是SEQ ID NO:2所示的序列。


说明书

鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的引物、方法及应用


技术领域

本发明属于生物检测领域,具体涉及鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的引物
及方法。

背景技术

疟疾是一种严重危害人类健康、影响社会经济发展的重要寄生虫病,根据世界卫
生组织(WHO)统计,2016年全球有91个国家和地区流行疟疾,病例数为2.16亿,比2015年增
加500万,死亡数为44.5万。2016年,我国共报告疟疾病例3321例。

在世界各国政府和国际组织的努力下,自2000年至2016年,疟疾发病人数减少
18%,致死人数下降了47%。然而,近年来在东南亚的缅甸、老挝、柬埔寨、泰国和越南分别出
现了疟原虫对青蒿素产生耐药性的报导,表现为患者经青蒿素治疗后疟原虫被延迟清除。
虽然目前暂时没有证据显示发生在东南亚地区的青蒿素耐药性波及中国,但曾经有效的疟
疾防治措施面临严峻挑战。

尽管针对疟疾疫苗的研究工作已经开展几十年,但至今仍未能研制出能够用于现
场对抗疟疾感染有效的疫苗。疟原虫生活史复杂,人体内发育包括红内期和红外期,红内期
是指裂殖子入侵后在红细胞内形成环状体,经发育繁殖形成裂殖体,并引起人体致病乃至
致命。由于疟原虫红内期是疟疾致病的主要阶段,红内期疫苗既可预防疟原虫感染,也可用
于疟疾感染病人的治疗。因此,疟原虫红内期疫苗候选分子的筛选和鉴定得到了国内外科
学家的格外重视。

疟疾的流行除受社会、自然和文化环境影响之外,其本身复杂多样的遗传结构亦
是影响疟疾流行的重要原因。不同地理株间日疟原虫存在表型差异,多表现在药物抗性及
毒力、生长繁殖、基因表达、入侵红细胞和配子体产生等方面。疟原虫裂殖子入侵宿主红细
胞包括识别与粘附、定向、紧密接触等过程,需要裂殖子表面配体与红细胞表面受体相互作
用,故参与疟原虫入侵宿主红细胞的裂殖子表面蛋白(Merozoite surface protein,MSP)
是红内期疫苗研究的重要靶点。MSP3α基因属于MSP3基因家族,该家族是间日疟原虫入侵红
细胞的关键蛋白。本发明研究分析中缅边境地区间日疟原虫PvMSP-3α基因的多态性特点及
其影响因素,评估其在不同地理区域和不同人群中的多态性变化水平。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性
的特异性引物。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性
的方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供该鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的
特异性引物在制备鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的检测工具中的应用。

本发明首先提取待测间日疟原虫基因组DNA,然后通过对间日疟原虫PvMSP-3α基
因进行PCR扩增,将所获得的扩增产物送测序,经序列比对后,得到多态性鉴定结果。

为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:

本发明第一个方面是提供了一对鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的特异性引物
(即用于间日疟原虫PvMSP-3α基因PCR扩增的特异性引物),其序列为:

上游:5′- CTATTCGCACCGAACAGTCA -3′(如SEQ ID NO:1所示);

下游:5′- ATCGCCCCAATTTGTCGTAT -3′(如SEQ ID NO:2所示)。

本发明第二个方面提供了一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的方法,包括
如下步骤:

1)提取待测间日疟原虫基因组DNA;

2)间日疟原虫PvMSP-3α基因序列的扩增(用PCR技术从含有目的基因的间日疟原虫基
因组DNA中获取间日疟原虫PvMSP-3α的DNA片段):以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核
苷酸序列为引物,以提取的待测间日疟原虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增;

3)分别将扩增产物送测序,经序列比对后,得到多态性鉴定结果。

作为本发明优选的技术方案,步骤1)具体为:用打孔器将被间日疟原虫感染的病
人的血滤纸片剪裁成多枚小片,放入离心管中,按照试剂盒的操作手册,提取待测间日疟原
虫基因组DNA。

作为本发明优选的技术方案,步骤2)中,所述PCR扩增的反应条件为98℃预变性
3.0 min,98℃变性10 sec,60℃退火15 sec,68℃延伸4.0 min,35个循环;68℃延伸10
min,最后保存于4℃。

作为本发明优选的技术方案,步骤2)中,所述PCR扩增反应体系包括5 x
PrimeSTAR GXL Buffer缓冲液5.0μl;2.5mM dNTP Mixture 2.0μl;10μM上游引物1.0μl;10
μM下游引物1.0μl;DNA模板 3.0μl;PrimeSTAR GXL DNA Polymerase聚合酶0.5μl;无核酸
酶水12.5μl。

本发明第三个方面提供上述鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的特异性引物
在制备鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的检测工具中的应用。本发明中提供的一对用
于间日疟原虫PvMSP-3α基因PCR扩增的特异性引物,上游引物的序列是SEQ ID NO:1所示的
序列,所述下游引物的序列是SEQ ID NO:2所示的序列,该特异性引物可以用于制备成专门
鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的检测工具。检测工具包括生物检测领域中各种常见
的产品,如基因芯片、试剂盒等。

与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明中筛选出的上下游引物与PCR
扩增反应条件具有较强的特异性,条带单一,能准确检测出间日疟原虫的MSP-3α基因。经对
比试验筛选,3组引物中,出乎意料地发现只有一组引物成功扩增出PvMSP-3α基因,其余2组
引物皆未成功扩增出目的片段,且该组引物试验结果条带单一,特异性强,能准确检测出间
日疟原虫的MSP-3α基因,达到了预料不到的技术效果。根据基因多态性区域特征,本发明设
计特定的引物,经PCR扩增得到包含保守区域和多态性区域的DNA片段,通过测序、分析,能
够对PvMSP-3α基因是否突变进行鉴定,进而区分出是野生型还是突变型。采用本发明的特
异性引物及检测方法能够有效的鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性。经鉴定,中缅边境
地区32个样本PvMSP-3α基因中,野生型占25%(8/32),突变型占75%(24/32),NJ进化树见图
2。π值为0.01601(见图3);Ka/Ks值为0.37,为净化选择。

附图说明

图1是实施例1中间日疟原虫PvMSP-3α基因扩增结果示意图。图1中,M:DNA分子量
标准;1-2:PCR产物。

图2是实施例1中间日疟原虫PvMSP-3α基因NJ进化树分析图。

图3是实施例1中间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性π值分析图。

图4是实施例1中间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性Tajima’s D值的分析图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施
例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技
术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范
围。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体
条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的鉴定

1 材料

1.1 间日疟原虫基因组DNA

来自于被间日疟原虫感染的病人的血滤纸片,从中缅边境地区(China-Myanmar
border,CMB)的疟疾流行区采集。用打孔器将血滤纸片剪裁成直径约3cm的小片,3枚,放入
1.5ml离心管中,按照QIAGEN公司的DNA抽提试剂盒( QIAamp DNA Blood Mini Kit)的操作
手册,提取待测间日疟原虫基因组DNA。

1.2 主要试剂


2 方法

2.1 间日疟原虫PvMSP-3α基因的扩增

根据间日疟原虫标准株PvMSP-3α基因为目的扩增片段,利用上海英骏生物技术有限公
司引物设计软件设计3对特异性引物,该特异性引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引
物序列分别如下:

1)第1组引物:

上游:5′- CTATTCGCACCGAACAGTCA -3′(如SEQ ID NO:1所示);

下游:5′- ATCGCCCCAATTTGTCGTAT -3′(如SEQ ID NO:2所示)。

2)第2组引物:

上游:5′-TCAACATTTAGCTGCCACCA-3′(如SEQ ID NO:3所示);

下游:5′-ATCGCCCAATTTGTCGTAT-3′(如SEQ ID NO:2所示)。

3)第3组引物:

上游:5′- CTATTCGCACCGAACAGTCA -3′(如SEQ ID NO:1所示);

下游:5′-CGCCCCAATTTGTCGTATATT -3′(如SEQ ID NO:4所示)。

以间日疟原虫基因组DNA作为模板,分别以上述3组引物进行PCR扩增。反应条件为
98°C预变性3.0 min,98°C变性10 sec,50至70°C(梯度)退火15 sec,68°C延伸4.0 min,35
个循环;68°C延伸10 min 最后保存于4°C。DNA聚合酶购自TaKaRa。反应体系为25.0μl,具体
为5 x PrimeSTAR GXL Buffer(缓冲液)5.0μl;dNTP Mixture (2.5mM each) 2.0μl;
Primer F(上游引物)(10μM each) 1.0μl;Primer R(下游引物)(10μM each) 1.0μl;
Template DNA(DNA模板)3.0μl;PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(聚合酶)0.5μl;
Nuclease-free water(无核酸酶水)12.5μl。

通过使用不同的引物组合,以及不同的退火温度来筛选最适的扩增条件。

2.2 间日疟原虫PvMSP-3α基因扩增产物的测序和序列分析

将PCR扩增成功的产物送上海华大基因公司进行测序,选用标准株作为参照。利用
BioEdit软件对所获得的基因序列进行排序分析,利用MEGA6.0等软件评估序列多态性。

3 结果

3.1间日疟原虫PvMSP-3α基因的扩增

以间日疟原虫基因组DNA作为模板,进行PCR扩增,使用第1组引物,选择60°C退火15
sec扩增出2719bp与预期长度一致的目的片段(见图1),表明成功扩增出PvMSP-3α基因。其
余引物组合(第2组引物和第3组引物)和退火温度皆未成功扩增出目的片段。

3.2 间日疟原虫PvMSP-3α基因扩增产物的测序和序列分析

3.2.1 测序分型结果

PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司测序。测序结果显示,
PvMSP-3α基因32个样本中,野生型占25%(8/32),突变型占75%(24/32),NJ进化树见图2。

3.2.2 π分析

以MEGA4.1软件分析中缅边境32个样本PvMSP-3α核苷酸序列多态性结果显示π值为
0.01601(见图3),利用KaKs_caculater软件LWL模型分析32个序列,结果显示CMB地区样本
PvMSP-3α基因的Ka/Ks值为0.37,为净化选择。

3.2.3 Tajima检验

PvMSP-3α的Tajima’s D值为1.33055,表明中缅边境地区间日疟原虫的MSP-3α基因正
受到平衡选择(见图4)。

4 讨论

疟疾的流行除受社会、自然和文化环境影响之外,其本身复杂多样的遗传结构亦是影
响疟疾流行的重要原因。不同地理株间日疟原虫存在表型差异,多表现在药物抗性及毒力、
生长繁殖、基因表达、入侵红细胞和配子体产生等方面。疟原虫裂殖子入侵宿主红细胞包括
识别与粘附、定向、紧密接触等过程,需要裂殖子表面配体与红细胞表面受体相互作用,故
参与疟原虫入侵宿主红细胞的裂殖子表面蛋白(Merozoite surface protein,MSP)是红内
期疫苗研究的重要靶点。MSP3α基因属于MSP3基因家族,该家族是间日疟原虫入侵红细胞的
关键蛋白。本研究分析中缅边境地区间日疟原虫PvMSP-3α基因的多态性特点及其影响因
素,评估其在不同地理区域和不同人群中的多态性变化水平。

本发明公开了一种鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的引物及方法,PvMSP-3α
多态性的影响因素分析,可为以PvMSP-3α为基础建立有效传播阻断疫苗的研究提供一定的
线索。同时对基因型序列的了解,对于判断传染来源,了解病例是输入感染还是当地感染具
有重要的作用。

综上所述,上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本
发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应
包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120>鉴定间日疟原虫PvMSP-3α基因多态性的引物、方法及应用

<130> WH-NP-18-100027

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

ctattcgcac cgaacagtca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

atcgccccaa tttgtcgtat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

tcaacattta gctgccacca 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<220>

&lt...

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图1
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